粪便细菌学规范

 时间:2018-07-01 19:40:19 贡献者:珠珠秀之

导读:粪便细菌学检验操作规范实验室常规检查是细菌培养,沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌和 实验室常规检查是细菌培养,沙门氏菌、志贺氏菌、 气单胞菌、 副溶血性弧菌、 致泻性大肠杆菌作

免费文档 所有分类 自然科学 生物学 脓汁和粪便标本中病原菌的检测-1
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粪便细菌学检验操作规范实验室常规检查是细菌培养,沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌和 实验室常规检查是细菌培养,沙门氏菌、志贺氏菌、 气单胞菌、 副溶血性弧菌、 致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养的主 气单胞菌、 副溶血性弧菌、 致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养的主 要腹泻病原菌。

要腹泻病原菌。

标本采集与运送: 一 、标本采集与运送: 1.标本采集 . (1)标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。

在不同 )标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。

份标本可以提高致病菌的分离率。

的时间采集 2~3 份标本可以提高致病菌的分离率。

(2)自然排便采集粪便标本时,取有脓血、粘液、组织碎片部分的 )自然排便采集粪便标本时,取有脓血、粘液、 粪便 1~3g。

液体粪便则取絮状物,一般取 1~3ml,直接装入粪便 ~ 。

液体粪便则取絮状物, ~ , 容器或保存液或运送培养基中送检。

容器或保存液或运送培养基中送检。

(3)直肠拭子采集粪便标本,检查带菌者时可以采取肛拭(棉拭先 )直肠拭子采集粪便标本,检查带菌者时可以采取肛拭( 采集粪便标本 可以采取肛拭 用保存液或增菌培养基湿润) ,深入肛门内 除采样, 用保存液或增菌培养基湿润) 深入肛门内 7~10cm 除采样,不能及 , 时接种时,应将标本放入保存液内。

时接种时,应将标本放入保存液内。

(4)容器应清洁、带盖、广口的(不宜使用纸盒) 送检的标本中不 容器应清洁、带盖、广口的(不宜使用纸盒) 、送检的标本中不 容器应清洁 、 能加入防腐剂。

能加入防腐剂。

2. 标本运送 . (1)粪便标本应尽快送检,室温条件下不能超过 2h。

如不能及时送 )粪便标本应尽快送检, 。

的磷酸盐甘油或转运培养基, 检可加入 pH7.0 的磷酸盐甘油或转运培养基,但不宜超过 24h。

使用 。

培养基时,不能运送培养志贺氏菌的标本。

改良 Cary-Blair 培养基时,不能运送培养志贺氏菌的标本。

肉汤中送检, (2)直肠拭子采集的标本必须置入运送培养基或 GN 肉汤中送检, ) 转运时间不宜超过 2h。

(3)高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要 ) 求。

(4)直肠活检标本用粪便容器送检,内盛少量无菌蒸馏水以防止沉 )直肠活检标本用粪便容器送检, 淀。

3.标本保存 . 不能及时检验的标本通常 4-6℃保存,用磷酸缓冲盐甘油溶液保 ℃保存, 存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本,保存培养弯曲杆菌和弧菌的标 存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本, 本,需加 CaCl2(100mg/L)。

二、标本镜检 粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞, 粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞,提示侵袭性致病菌感 如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻, 革兰氏染色结果可以提示是 染。

如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻, 酵母菌还是葡萄球菌感染。

酵母菌还是葡萄球菌感染。

2. 革兰氏染色 制备一张薄的粪便涂片, 采用常规革兰氏染色方法。

制备一张薄的粪便涂片, 采用常规革兰氏染色方法。

常规革兰氏染色方法 镜下观察是否有 大量 WBCs,成丛的革兰氏阳性球菌,酵母菌。

,成丛的革兰氏阳性球菌,酵母菌。

3.水样粪便的标本,采用悬滴法暗视野(或相差显微镜)镜检,如发 水样粪便的标本,采用悬滴法暗视野(或相差显微镜)镜检, 水样粪便的标本 现细菌呈穿梭状极活泼的运动,则考虑为弧菌感染。

加入 O1 群霍乱 现细菌呈穿梭状极活泼的运动,则考虑为弧菌感染。

血清, 弧菌诊断多价血清或 O139 血清, 显微镜下观察若运动停止则为抑动 试验阳性。

试验阳性。

采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌,革兰阴性弧形、 采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌,革兰阴性弧形、S 形或螺旋形的小杆菌,提示弯曲杆菌感染。

形或螺旋形的小杆菌,提示弯曲杆菌感染。

三、细菌培养及培养基的选择

1.腹泻病原菌常规培养 . 对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养, 对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养, 包括沙门氏菌、 包括沙门氏菌、 志贺氏菌、 志贺氏菌、 致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌,致病性弧菌。

此外, 致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌,致病性弧菌。

此外,也包括 胞菌 可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌和酵母菌。

粪便标 可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌和酵母菌。

本至少应接种血平皿、 ( 、EMB(或 MAC 或中国兰) 或中国兰) 本至少应接种血平皿、HE(XLD 或 SS) ) 、 ( 等培养基。

琼脂培养基。

等培养基。

沿海地区还需增加 TCBS 琼脂培养基。

补充说明: 补充说明: (1)SS 培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。

) 培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。

对气单胞菌、 (2)常用的肠道选择性培养基(如 SS 等)对气单胞菌、邻单胞菌 )常用的肠道选择性培养基( 有抑制作用, 有抑制作用,初次分离时应接种血平皿和 MAC。

(3)若用 EMB(伊红美兰) MAC(麦康凯)等培养基培养后,未 ) (伊红美兰) 、 (麦康凯)等培养基培养后, 检出常见致病菌, 检出常见致病菌, 但感染性腹泻症状明显, 但感染性腹泻症状明显, 可重新采集粪便标本接种 GN 肉汤,35℃培养 4-6h,再转种 HE(肠道琼脂)等培养基,进 肉汤, ℃ , (肠道琼脂)等培养基, 一步分离培养。

一步分离培养。

肉汤(亚硒酸盐增军液) (4)如怀疑沙门氏菌感染,可先用 SF 肉汤(亚硒酸盐增军液) 以 )如怀疑沙门氏菌感染, , 提高检出率。

提高检出率。

(5)正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌,因此只有每克粪便 )正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌, 时才有临床意义。

细菌数达到 105CFU 时才有临床意义。

上生长, (6)气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如 MAC 和 EMB 上生长, ) 但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。

选择性培养基: 但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。

选择性培养基:每 10ml 的 BAP(血琼脂平板)培养基加入 10mg 氨苄西林(BAP-AMP) (血琼脂平板) 氨苄西林( ) 。

(7)邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如 MAC 或 HE 生长,但 ) 生长,

选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。

选择性培养基: 琼脂( 选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。

选择性培养基:IBB 琼脂(肌 更有助于检出邻单胞菌 醇-亮绿 胆盐琼脂) 亮绿-胆盐琼脂) 亮绿 胆盐琼脂 。

2.腹泻病原菌的增菌培养 . 早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养, 早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养,能提高低数量菌的检出 率。

常用增菌液有: 常用增菌液有: GN 肉汤:用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养,严格保证培养 4-6h 肉汤:用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养, 后即进行传代。

后即进行传代。

SF 肉汤:主要用于沙门氏菌的增菌培养,经 36℃培养 24h 后,接种 肉汤:主要用于沙门氏菌的增菌培养, ℃ 鉴别培养基进行分离培养。

鉴别培养基进行分离培养。

TT 肉汤:主要用于沙门氏菌的增菌培养,但不包括伤寒沙门氏菌和 肉汤:主要用于沙门氏菌的增菌培养, 副伤寒沙门氏菌, 后尽快传代。

副伤寒沙门氏菌,培养 12h 后尽快传代。

碱性蛋白胨水:主要用于弧菌增菌, 35-37℃培养 5-8h 后,传代到 碱性蛋白胨水:主要用于弧菌增菌, ℃ TCBS 平板上培养。

平板上培养。

四、培养物鉴定 1、志贺氏菌的鉴定 、 个种即痢疾志贺氏菌( 、福氏志贺 志贺氏菌属包括 4 个种即痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae) 福氏志贺 ) 、 氏菌 ( S.flexneri ) 鲍氏志贺氏菌 ( S.boydii ) 宋内氏志贺氏菌 、 、 。

志贺氏菌血清学分群分为 、 、 、 四群。

目前, (S.sonnei) 志贺氏菌血清学分群分为 A、B、C、D 四群。

目前, ) 。

A 群含有 15 个血清型,B 群含有 8 个血清型(前 5 个血清型又进一 个血清型, 个血清型( 个亚型) ,C 个血清型, 个血清型。

步分为 11 个亚型) 群含有 19 个血清型,D 群只含有 1 个血清型。

, 对于肠道培养基上可疑为志贺氏菌的菌落, 首选鉴定试验: 赖氨酸脱 对于肠道培养基上可疑为志贺氏菌的菌落, 首选鉴定试验: 羧酶试验、动力试验、葡萄糖产气试验、粘液酸盐试验、克氏柠檬酸 羧酶试验、动力试验、葡萄糖产气试验、粘液酸盐试验、

盐试验、乙酸盐实验。

个试验均为阴性。

盐试验、乙酸盐实验。

志贺氏菌上述这 7 个试验均为阴性。

志贺氏菌 还必须进行血清学鉴定, 还必须进行血清学鉴定, 可使用玻片凝集方法。

可使用玻片凝集方法。

但对于生化试验符合 志贺氏菌而血清凝集试验弱阳性或不凝集时, 志贺氏菌而血清凝集试验弱阳性或不凝集时,应制备生理盐水菌悬 100℃ 冷却后观察自凝现象, 如果自凝试验阴性, 液, ℃水溶 15~30min, , 冷却后观察自凝现象, 如果自凝试验阴性, 再进一步使用抗血清做凝集试验。

再进一步使用抗血清做凝集试验。

2、沙门氏菌的鉴定 、 沙门氏菌种及其亚种鉴定 沙门氏菌属在含有乳糖的鉴别培养基经 ℃ 沙门氏菌属在含有乳糖的鉴别培养基经 36℃培养 18-24h 后, 其菌落 一般为无色透明或半透明,中等大或叫较小,边缘整齐、光滑, 一般为无色透明或半透明,中等大或叫较小,边缘整齐、光滑,稍呈 隆起。

多数沙门氏菌因产生硫化氢, 隆起。

多数沙门氏菌因产生硫化氢,在 SS、HE 培养基上可形成中心 、 带黑色或墨绿色的菌落。

带黑色或墨绿色的菌落。

或墨绿色的菌落 生化反应鉴定为沙门氏菌或志贺氏菌的菌株还要进行血清学鉴定确 定菌体抗原( 抗原) 。

沙门氏菌和志贺氏菌都应进一步进行血清学 定菌体抗原(O 抗原) 沙门氏菌和志贺氏菌都应进一步进行血清学 。

和全面生化鉴定。

和全面生化鉴定。

3、 弯曲杆菌的鉴定 、 后检查弯曲杆菌的特征性菌落:有扁平的、 培养 24-48h 后检查弯曲杆菌的特征性菌落:有扁平的、能扩散 的、可以弥漫整个平板表面的菌落;有很小的、凸起的、半透明的菌 可以弥漫整个平板表面的菌落;有很小的、凸起的、 落。

颜色可为灰色、黄色或粉红色。

氧化酶试验阳性。

颜色可为灰色、黄色或粉红色。

氧化酶试验阳性。

取可疑形态菌落进行革兰氏染色。

由于常规革兰氏染色时弯曲杆 取可疑形态菌落进行革兰氏染色。

菌不易着色, 菌不易着色,可用蕃红或石炭酸复红染液染片 3min。

最适于弯曲杆 。

菌的染色方法是用 0.1% 的碱性复红染液染片 3min。

显微镜下观察 。

弯曲杆菌是小的、轻度弯曲的 G—杆菌,呈“S”型或海鸥型。

弯曲杆菌是小的、 杆菌, 型或海鸥型。

杆菌 型或海鸥型

动力试验:弯曲杆菌悬于肉汤培养液如营养肉汤或 Mueller-Hinton(M-H)肉汤中, 肉汤中, 用相差显微镜或光学显微镜观察动力, 肉汤中 用相差显微镜或光学显微镜观察动力, 盐水和蒸馏水可能抑制其动力。

盐水和蒸馏水可能抑制其动力。

血清学试验: 用玻片乳胶凝集试验商品试剂盒能鉴定到属的水平即空 血清学试验: 肠弯曲杆菌、海鸥弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。

肠弯曲杆菌、海鸥弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。

此试验是检测以上 3 种细菌的细胞壁抗原。

当抗原与用弯曲杆菌抗体包被的乳胶颗粒悬液 种细菌的细胞壁抗原。

发生反应时即产生凝集现象。

发生反应时即产生凝集现象。

凝集现象 DNA 探针:DNA 探针商品试剂盒能鉴定出空肠弯曲杆菌、大肠弯曲 探针: 探针商品试剂盒能鉴定出空肠弯曲杆菌、 杆菌和海鸥弯曲杆菌, 但不能进行种间鉴别。

该试剂盒利用非放射性 杆菌和海鸥弯曲杆菌, 但不能进行种间鉴别。

内即获得快速检测结果。

检测系统 4h 内即获得快速检测结果。

快速马尿酸盐水解试验: 马尿酸盐试验阳性鉴定为空肠弯曲杆菌, 马 快速马尿酸盐水解试验: 马尿酸盐试验阳性鉴定为空肠弯曲杆菌, 尿酸盐试验阴性需进一步鉴定。

尿酸盐试验阴性需进一步鉴定。

萘丁酸和头孢噻吩敏感试验: 制备 2-3mlBHI 或 Mueller-Hinton(M-H) 萘丁酸和头孢噻吩敏感试验: 肉汤微菌悬液。

将菌悬液均匀涂布于血平板使菌落融合生长。

肉汤微菌悬液。

将菌悬液均匀涂布于血平板使菌落融合生长。

再将 30ug 萘丁酸和 30ug 头孢噻吩纸片贴在平板上。

头孢噻吩纸片贴在平板上。

在弯曲杆菌的微需氧 环境下培养 环境下培养 24h,如纸片周围出现抑菌环为敏感。

,如纸片周围出现抑菌环为敏感。

4、弧菌的鉴定 、 平板, 观察培养后的 TCBS 平板,挑选符合弧菌菌落颜色和生长特征的菌 落进行鉴定,生化筛选结果阳性的菌落应进行全面生化鉴定。

落进行鉴定,生化筛选结果阳性的菌落应进行全面生化鉴定。

TCBS 后方能报告阴性结果。

平板上培养 48h 后方能报告阴性结果。

一些大肠杆菌、 培养基中生长, 一些大肠杆菌、弯曲杆菌和肠球菌也可以在 TCBS 培养基中生长, 但通常情况下其菌落小且为半透明。

但通常情况下其菌落小且为半透明。

变形杆菌发酵蔗糖产生的黄色菌

落一定要仔细与弧菌的黄色菌落相区别。

邻单胞菌和气单胞菌都可以 落一定要仔细与弧菌的黄色菌落相区别。

在 TCBS 平板上生长,它们通常形成蓝色菌落。

选血平板上非假单 平板上生长,它们通常形成蓝色菌落。

胞菌落进行氧化酶试验, 氧化酶阳性可能为弧菌或气单胞菌。

常规肠 胞菌落进行氧化酶试验, 氧化酶阳性可能为弧菌或气单胞菌。

道培养基上生长的弧菌不发酵乳糖。

道培养基上生长的弧菌不发酵乳糖。

与腹泻性疾病相关的弧菌要鉴定到“种 的水平 嗜水气单胞菌易被错 的水平。

与腹泻性疾病相关的弧菌要鉴定到 种”的水平。

误鉴定为河弧菌。

个试验鉴别: 误鉴定为河弧菌。

河弧菌可通过以下 1 个或 2 个试验鉴别:O/129 敏 感试验(备 0.5 McFarland 标准菌悬液,涂布 M-H 琼脂平板,贴上 感试验( 标准菌悬液, 琼脂平板, 50ugO/129 的纸片,35-37℃培养 24h,观察抑菌环,河弧菌O/129 的纸片, ℃ ,观察抑菌环,河弧菌O 敏感,气单胞菌O 耐药) ;NaCl 刺激生长试验(分别接种不含 刺激生长试验( 敏感,气单胞菌O/129 耐药) ; NaCl 和含 1% NaCl 的营养肉汤,35-37℃培养 18-24h,观察生长状 的营养肉汤, ℃ , 的营养肉汤中均不生长 肉汤中均不生长, 况。

气单胞菌在不含 NaCl 和含 1%NaCl 的营养肉汤中均不生长, 河弧菌是一种嗜盐弧菌,没有 NaCl 不生长,在含 1%的 NaCL 营养 河弧菌是一种嗜盐弧菌, 不生长, 的 肉汤中生长。

肉汤中生长。

血清学鉴定霍乱弧菌: 抗血清鉴定霍乱弧菌。

血清学鉴定霍乱弧菌:用霍乱弧菌 O1 抗血清鉴定霍乱弧菌。

O1 群 群霍乱弧菌都能引起霍乱样疫病, 霍乱弧菌和非 O1 群霍乱弧菌都能引起霍乱样疫病,但 O1 群菌株最 易引起流行。

将可疑菌落尽早用非选择性培养基进行密集划线传代, 易引起流行。

将可疑菌落尽早用非选择性培养基进行密集划线传代, 35-37℃培养 5-8h 后制成奶样菌悬液,在玻片上将 1 滴此菌悬液与 1 ℃ 后制成奶样菌悬液, 滴抗血清混合, 滴抗血清混合,晃动玻片 1min,观察是否凝集,凝集反应阳性提示 ,观察是否凝集, 然后再通过生化反应验证血清学鉴定。

为霍乱弧菌 O1 群,然后再通过生化反应验证血清学鉴定。

实验室如 群抗血清储备, 一定要将霍乱弧菌分离物送至当地卫生防疫 果无 O1 群抗血清储备, 一定要将霍乱弧菌分离物送至当地卫生防疫 机构实验室。

机构实验室。

5、致病性大肠埃希氏菌的鉴定 、

目前尚无稳定特异的生化试验能鉴别粪便标本中致病性大肠埃 希氏菌和非致病性大肠埃希氏菌。

EPEC、ETEC、EIEC 和 STEC 希氏菌和非致病性大肠埃希氏菌。

、 、 的血清型只作为鉴定致病性大肠埃希氏菌的一个方面。

确证大肠埃希 的血清型只作为鉴定致病性大肠埃希氏菌的一个方面。

氏菌致病性的方法有:细胞毒素测定、侵袭试验、 氏菌致病性的方法有:细胞毒素测定、侵袭试验、DNA 探针检测致 病基因、组织培养测定细胞毒素等。

病基因、组织培养测定细胞毒素等。

(1)STEC(以前称 EHEC):发病 5 天内留取粪便标本,大肠埃希 ) ( ) 发病 天内留取粪便标本, 氏菌 O157: 是最常见的能引起出血性结肠炎的血清型, EPEC :H7 是最常见的能引起出血性结肠炎的血清型,但 O26:H11 和 O111 也能产生细胞毒素而引起此综合征。

在山梨醇麦 : 也能产生细胞毒素而引起此综合征 素而引起此综合征。

康凯培养基上为无色菌落。

康凯培养基上为无色菌落。

鉴定: 鉴定:选择 5-10 个乳糖阳性菌落接种于山梨醇麦康凯平板培养基上 进行山梨醇发酵试验, 进行山梨醇发酵试验 ,选择 5-10 个山梨醇发酵试验阴性菌落进行 O157 抗血清和 H 抗血清试验,用 O157 抗血清凝集阳性的菌落进行 抗血清试验, 生化鉴定。

赫氏埃希氏菌( 抗血清。

生化鉴定。

赫氏埃希氏菌(E.hermannii)也能凝集 O157 抗血清。

) 致病性研究:检测粪便中的细胞毒素和分离物产生细胞毒素的能力。

致病性研究:检测粪便中的细胞毒素和分离物产生细胞毒素的能力。

可以在粪便标本中产生细胞毒素。

大肠埃希氏菌 O157 及其它 STEC 可以在粪便标本中产生细胞毒素。

H7 将经过鉴定的大肠埃希氏菌 O157: 提交有关实验室进行细胞毒素 : 检测。

注意:不是所有的 O157:H7 血清型都可产生细胞毒素。

检测。

: 血清型都可产生细胞毒素。

(2)ETEC :在初次分离培养基上 ETEC 不能与其它非致病性大肠 ) 埃希氏菌相区别。

埃希氏菌相区别。

从初次分离平板上取 10 个菌落分别进行埃希氏菌 纯化培养、鉴定为大肠埃希氏菌。

对可疑菌株进行毒素研究, 纯化培养、鉴定为大肠埃希氏菌。

对可疑菌株进行毒素研究,将上述 10 个菌落的分离物进行热稳定或热不稳定肠毒素试验 , 方法有 个菌落的分离物进行热稳定或热不稳定肠毒素试验, ELISA 法、胶乳凝集试验或 DNA 探针技术。

如高度可疑应将分离物 探针技术。

和粪便标本送到有关实验室检测。

和粪便标本送到有关实验室检测。

(3)EIEC、EPEC: EIEC 和 EPEC 均不能与非致病性大肠埃希氏 、 : 菌相区别, 个可疑大肠埃希氏菌落进行生化鉴定 化鉴定。

菌相区别,对 5-10 个可疑大肠埃希氏菌落进行生化鉴定。

将分离物 和粪便标本送到有关实验室进行血清学和致病性研究。

和粪便标本送到有关实验室进行血清学和致病性研究。

 
 

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